Fago lambda: infezione e replicazione

FAGO LAMBDA: UN VIRUS CHE INFETTA ESCHERICHIA COLI

Enterobacteria fago λ, più comunemente noto come fago lambda, è un batteriofago temperato che infetta Escherichia coli. Si tratta di un virus ampiamente utilizzato nei laboratori di biologia molecolare poiché è utile alle tecniche di clonaggio genico che sfruttano vettori fagici. Un batteriofago, o fago, non è altro che un virus che infetta esclusivamente cellule batteriche sfruttando il loro apparato biosintetico per effettuare la propria replicazione. L’infezione virale del batterio ne causa la morte per lisi, ossia mediante rottura della membrana plasmatica dovuta all’accumulo delle nuove particelle virali nel citoplasma. In linea generale, possiamo affermare che il genoma di un batteriofago è caratterizzato dalla presenza di promotori molto simili a quelli batterici: in questo modo, i promotori del DNA virale sono facilmente riconoscibili dalle polimerasi batteriche che al momento dell’infezione cominciano a trascrivere il genoma fagico permettendo, quindi, la replicazione del virus.

Il DNA che si trova nella testa fagica, all’interno del capside, è ad altissima pressione e fortemente compatto. Una volta che la coda proteica del fago ha perforato la parete cellulare e il plasmalemma batterici, il DNA fagico viene spontaneamente rilasciato all’interno della cellula batterica. Con la penetrazione del genoma fagico all’interno della cellula batterica, viene quindi avviato il processo di infezione. A questo punto, la strada che può prendere il genoma virale è duplice: il DNA del virus può andare incontro a ciclo litico o a lisogenia. Nel primo caso, il fago si replicherà subitaneamente portando ben presto il batterio alla morte per lisi della membrana cellulare; nel secondo caso, il fago si trasformerà in profago, introducendo il suo genoma in quello batterico attraverso uno specifico processo di ricombinazione e raggiungendo uno stato di iniziale dormienza. La lisogenia è utile al fago poiché permette al genoma virale di propagarsi per diverse generazioni di cellule batteriche attraverso successive replicazioni che il genoma batterico compie ad ogni evento di scissione binaria: ciò permette, quindi, al virus di produrre un’infezione molto più efficace. La scelta fra la via litica e quella lisogenica è determinata dalle condizioni in cui versa il batterio, soprattutto per quanto riguarda la quantità di nutrienti che la cellula ha a disposizione. Laddove la cellula batterica risulti carente nei nutrienti essenziali al suo metabolismo, verrà preferita la via lisogenica: la via litica non potrebbe essere sostenuta dal batterio che, visto il suo metabolismo rallentato, non riuscirebbe a produrre tutte le strutture molecolarmente utili alla replicazione del genoma fagico, quindi il fago morirebbe con il batterio. Se, invece, la cellula è sana e ricca di nutrienti si preferisce la via litica.

BIOLOGIA MOLECOLARE DEL FAGO LAMBDA

Il genoma del fago lambda conta circa 48000 paia di basi ed è lineare. In caso di infezione, però, subito dopo aver penetrato la cellula batterica, il DNA del virus tende a chiudersi circolarmente sfruttando le ligasi batteriche. Il genoma del fago si compone di due distinte regioni:

• Una regione che comprende i geni strutturali per le proteine della testa e della coda;
• Una regione che comprende geni per le proteine a funzione regolatrice dei processi di lisi, replicazione del DNA fagico e ricombinazione, fra cui anche integrasi e proteine utili all’escissione del DNA fagico dopo la sua integrazione in quello batterico.

La trascrizione del DNA virale parte presso il gene che codifica per le proteine utili alla replicazione del genoma fagico. In questa regione sono presenti tre promotori differenti:

1. PL, che sta per promotore di sinistra (left primer);
2. PR, che sta per promotore di destra (right primer);
3. PRM, che sta per promotore per il mantenimento del repressore (repressor maintenance primer).

PR e PL sono due promotori forti, PRM è un promotore debole. Una volta penetrato il genoma fagico all’interno della cellula batterica, le polimerasi batteriche riconosceranno, quindi, uno dei due siti promotori utilizzabili, PL o PR: essendo che questi due promotori sono situati sui due filamenti opposti, permetteranno di trascrivere filamenti opposti, quindi la trascrizione potrà avvenire nei due versi in base al promotore scelto dalla polimerasi batterica. Mentre PL e PR si trovano sui due filamenti opposti, PRM e PR sono localizzati sullo stesso filamento. PR e PRM possiedono due sequenze di 6 basi ciascuna distanti circa 16-17 nucleotidi e poste rispettivamente a -10 e a -35, la cui stessa disposizione dimostra come la trascrizione dei geni a cui le sequenze promotrici fanno riferimento vanno trascritti in versi opposti. Osserviamo inoltre la presenza di tre siti operatori: OR1 in PR, OR3 in PRM e OR2 fra i due promotori. Allo stesso modo, presso PL sono presenti altri tre siti operatori, ancora una volta chiamati OR1, OR2 e OR3.

Il repressore del fago lambda

Il repressore del fago lambda è la proteina che può essere trascritta e prodotta a partire dal promotore PRM, indicata comunemente come proteina cI, e consiste nell’unica proteina che viene espressa in caso di lisogenia, utile allo stesso mantenimento dello stato di quiescenza del fago. Conta 236 aa e si presenta divisa in due domini legati da un linker di circa 40 aa:

• Il dominio carbossi-terminale permetta la dimerizzazione della proteina;
• Il dominio ammino-terminale si lega al DNA.

Essendo il repressore costituito da un omodimero, la sequenza del DNA sarà pressochè palindromica. La proteina cI presenta diverse caratteristiche specifiche che le consentono di essere utile come repressore del fago lambda in lisogenia: può tetramerizzare e ottamerizzare e presenta, inoltre, una regione attivatrice presso il suo dominio N-terminale. In qualità di co-attivatore, cI si lega all’operatore OR2 e favorisce il legame della polimerasi al PRM così che altra proteina cI possa essere prodotta. Essendo favorito da una maggiore affinità con la sequenza del promotore OR1, a basse concentrazioni la proteina cI si legherà a OR1, a concentrazioni poco più alte si legherà anche a OR2 e infine ad alte concentrazioni a OR3. La differenza tra OR2 e OR3 sta nel fatto che i legami di cI a OR2 e OR1 non sono indipendenti bensì cooperativi poiché i dimeri legatisi in OR2 e OR1 vanno a legarsi tramite le regioni carbossi-terminali della proteina a formare tetrameri. PRM è un promotore debole e ha quindi bisogno di un attivatore. Il repressore del fago lambda, quando è legato a OR2, favorisce il legame della RNA polimerasi a questo promotore aumentando di circa 10 volte la trascrizione di PRM. È stato dimostrato sperimentalmente che i repressori legati a OR interagiscono anche con OL per cooperatività. In particolare, si è visto che a interagire formando ottameri sono i repressori legati in OL1, OL2, OR1 e OR2. A permettere l’ottamerizzazione è la formazione di un loop della sequenza proteica di cI. In questo modo la repressione è massima e il profago risulta in uno stato di assoluta quiescenza mentre la regolazione è ottimizzata e resa particolarmente fine dalla cooperatività fra i dimeri di cI.

CHIUSURA DEL GENOMA E SITO COS

Abbiamo detto che il genoma fagico entra nella cellula batterica lineare e aperto ma appena raggiunge il citoplasma di questa si chiude a DNA circolare covalentemente chiuso. Questo processo è semplificato dalla caratteristica delle estremità del genoma di essere sfalsate: al momento della nascita del nuovo fago, infatti, una endonucleasi specifica aveva agito tagliando i due filamenti a due altezze differenti. In questo modo, la chiusura circolare del genoma del fago una volta che questo a penetrato la cellula batterica risulta semplificata: le due estremità appaieranno le basi complementari spontaneamente e una ligasi batterica interverrà a chiudere i nick rimasti. Il sito presso cui il genoma del fago, a seguito di nuova replicazione, viene tagliato in modo asimmetrico per garantire questa spontanea richiusura ad ogni nuova infezione viene detto sito cos. Questo è costituito da una sequenza palindromica ben riconoscibile dall’endonucleasi specifica e risulta fondamentale, nella sua sequenza, per i meccanismi molecolari legati alla replicazione del genoma fagico.

LE VARIE FASI DELL’INFEZIONE

La prima tappa dell’infezione consiste nella perforazione della parete e della membrana batterica con successiva iniezione del genoma fagico e trascrizione dei geni che presentano i promotori più forti. Sappiamo che questi sono PL e PR mentre PRM necessita di un attivatore. In una prima fase, detta fase precoce immediata, il genoma ciclizzerà e verranno prodotte solo le due proteine N e cro direttamente legate ai due promotori PL e PR. Nella fase precoce verranno trascritti i geni regolativi i quali saranno responsabili, uno in particolare, della scelta del fago di procedere a una fase tardiva di tipo litico o a una di tipo lisogenico: nel caso in cui venga scelta la via litica verranno trascritti e tradotti i geni per le proteine della testa e della coda, altrimenti si comincerà a produrre la proteina repressore del fago lambda, cI, e successivamente tutte le proteine integrasi necessarie all’integrazione del genoma fagico in quello batterico. Ma come si sceglie fra le due fasi? Una volta prodotta, la proteina cII espone sè stessa alle proteasi batteriche:

• se la cellula è in presenza di una grande quantità di nutrienti, le sue proteasi saranno numerose e attive nel citoplasma, quindi cII verrà velocemente degradata così che possa compiersi il ciclo litico;
• se la cellula si trova in condizione di carenza di nutrienti, invece, le proteasi saranno limitate in numero e attività, e senza la degradazione di cII verrà necessariamente compiuto il ciclo lisogenico.

Fase precoce immediata

Essendo PR e PL promotori forti, i primi due prodotti dell’espressione genica del fago sono rispettivamente le due proteine N e Cro che vi fanno riferimento. N è un regolatore genico che si presenta come attivatore in qualità di anti-terminatore sia per i geni che seguono PL che per quelli che seguono PR: questo si lega alla polimerasi e permette che questa superi i terminatori così che uno dopo l’altro tutti i geni regolativi possano essere trascritti e tradotti. Sul DNA fagico esiste una sequenza specifica detta Nut site, dall’inglese N utilisation site, che viene trascritta dalla polimerasi al momento della trascrizione a partire dal promotore PL Questa sequenza è utile a indurre il legame fra la polimerasi ed il regolatore N di modo che tutti i codoni di stop possano essere saltati senza che quindi la polimerasi si stacchi prima di aver terminato la trascrizione dei geni regolatori. A partire dal promotore PL si producono così N, cIII, xis e int. A partire da PR, invece, vengono prodotte le proteine Cro, cII, O, P e Q.

Fase precoce

È proprio durante la fase precoce che vengono trascritti e tradotti tutti i prodotti dei geni che seguono PL e PR grazie all’azione anti-terminatrice di N.
Si giunge quindi alla fase critica di scelta fra un ciclo litico e uno lisogenico:

• Si produrrà lisi se saranno attive le proteine Q e Cro;
• Si produrrà lisogenia se saranno attive cI, cII e cIII.

Fase tardiva litica

La fase tardiva litica si instaura se le proteine Cro e Q sono attive. Q è un anti-terminatore che funge da attivatore per le RNA polimerasi partite da PR’, una sequenza promotrice che si trova dopo il gene che codifica per Q e che quindi procede poi alla trascrizione dei geni strutturali per le proteine della testa e della coda del fago. Cro, intanto, è utile al blocco della lisogenia occupando i siti OR3, OR2 e infine OR1, ovviamente soltanto dopo che Q è stata prodotta in quantità sufficiente per indurre la lisi permettendo la produzione delle proteine per la struttura del fago.

Fase tardiva lisogenica

A regolare lo sviluppo della fase tardiva lisogenica sono sequenze promotrici diverse e specifiche. Per la via lisogenica è necessario produrre la proteina cI, che sappiamo va a bloccare i geni per la lisi. Il repressore del fago lambda, però, è sotto il controllo del un promotore debole PRM, che quindi necessita di un attivatore. Questo attivatore, però, cI stesso. Il processo, quindi, si verifica grazie a una iniziale produzione di cI a partire da un altro promotore, PRE, che a sua volta deve essere attivato da una proteina attivatrice: si tratta di cII, prodotta in fase precoce. Ricapitolando, cII va ad attivare il promotore PRE che quindi può produrre cII che a sua volta può bloccare cro. PRE è un promotore situato accanto a PRM e capace di produrre mRNA antisenso per spegnere la produzione Cro. La proteina cII, responsabile della sua attivazione, permette l’attivazione anche di altri promotori quali Pint e Pantiq:

• il promotore Pint produce mRNA del gene int, così che aumenti la concentrazione della proteina integrasi;
• il promotore Pantiq produce mRNA antisenso per interrompere la produzione di Q.

Per avere lisogenia, infatti, è necessario bloccare la produzione di entrambe le proteine Cro e Q. Quindi, per bloccare Cro si attiva PRE che attiva la produzione di cI, mentre per bloccare Q si attiva la trascrizione del gene che produce antiQ. Quest’ultimo promotore permette la produzione di un trascritto che legandosi complementariamente a parte del trascritto per Q alla sua estremità 5’, formando quindi una doppia elica, impedisce al ribosoma di individuare la sequenza RBS impedendo la produzione della proteina Q. A differenza di N e antiQ, cII è un attivatore classico: va a legarsi prima della sequenza promotrice in CAP per facilitare il legame della polimerasi al genoma. Scorrendo in versi opposti lungo lo stesso segmento genomico, le due polimerasi per Q e per antiQ usano i filamenti opposti per cui producono trascritti necessariamente complementari.
Grazie all’attivazione dei promotori indotta da cII, quindi, si producono proteine utili all’integrazione del genoma fagico in quello batterico, trascritti utili al blocco nella produzione di Q e la proteina cI per indurre il blocco di Cro.

INTEGRAZIONE DEL GENOMA FAGICO IN QUELLO BATTERICO

Durante la lisogenia viene prodotta la proteina int, un’integrasi per l’integrazione del genoma fagico in quello batterico. L’integrazione avviene attraverso un processo di ricombinazione sito-specifica che richiede la presenza di siti specifici di integrazione sul genoma fagico e su quello batterico. La sequenza specifica sul genoma di Escherichia coli viene detta attB, mentre quella sul genoma del fago attP (dall’inglese phage). Queste due sequenze sono identiche sui due DNA e ciò permette alle ricombinasi di effettuare uno scambio dei filamenti attraverso un meccanismo di crossing pairing. Con il processo di integrazione e l’inserimento del genoma fagico in quello batterico, i segnali di integrazione del genoma di coli passano quindi da uno a due poiché le sequenze utili alla ricombinazione sono identiche sui due genomi. In realtà, nonostante in questi siti potrebbero prodursi ulteriori ricombinazioni, questo non avviene poiché quando il fago si trasforma in profago (fago integrato nel genoma batterico) è molecolarmente capace di impedire ad altri fagi di effettuare infezione. L’integrazione avviene grazie ai residui di tirosina portati dall’enzima integrasi che si lega in duplice copia (una nel fago e una nel batterio) alle sequenze segnale per l’integrazione del genoma fagico in quello batterico. Si alternano una subunità attiva e una inattiva: legandosi al doppio filamento la tirosina della subunità attiva nel batterio, questa lega nucleofilicamente con l’ossigeno del suo ossidrile un fosfato di un filamento e rompe il ponte fosfodiestere, permettendo così all’estremità 3’-OH che rimane libera di attaccare nucleofilicamente con il suo ossigeno il fosfato del nucleotide legato alla tirosina nel genoma fagico. Lo stesso viene fatto a partire dal 3’-OH generato dall’integrasi che ha agito nel fago e che attaccherà il fosfato del nucleotide legato dall’integrasi sul genoma batterico. La fase intermedia viene ricordata come giunzione di Holliday. Un secondo ciclo di questo tipo permetterà anche agli altri due filamenti di fare lo stesso così che il genoma possa integrarsi completamente.

Controllo dell’integrazione

L’integrazione è controllata dalle proteine ricombinasi Xis e Int. Sappiamo che Int è utile all’integrazione del genoma fagico; Xis, invece, è coinvolta nell’excisione del profago dal genoma batterico. Per l’instaurazione della lisogenia, quindi, int deve essere favorito su xis. Int viene prodotto a partire da due promotori, Pint e PL, di cui Pint è un secondo promotore situato sul filamento opposto rispetto a PL, a livello di xis. Xis, invece, è prodotto solo da un promotore PL. Per la crescita litica diretta, quindi, Xis dovrà prevalere su Int mentre per la lisogenia Int dovrà prevalere su Xis.

Possibilità di induzione della lisi

Per indurre la lisi in un profago dobbiamo eliminare cI, il repressore del fago lambda, e a questo proposito possono essere utilizzati raggi ultravioletti. cI è mimato da un repressore batterico, LexA, strutturalmente simile. LexA è utile allo spegnimento dei geni coinvolti nella riparazione del DNA, in particolare quelli che riguardano i danni provocati da raggi UV. I raggi UV, infatti, possono provocare la formazione dei dimeri di timina e questi danni sono percepiti dalla cellula che attiva RecA che andrà quindi a tagliare LexA per attivare la trascrizione dei geni della riparazione del DNA. Essendo RecA e cI strutturalmente simili, quindi quando RecA è attivata taglierà anche cI. In questo modo, cI si staccherà da PL e PR che potranno trascrivere N e Cro e tutte le proteine necessarie per la via litica. Nell’induzione della lisi da parte di un profago xis e int devono avere concentrazioni simili.

LA REPLICAZIONE DEL GENOMA FAGICO

Finchè si trova all’interno del capside, il genoma fagico è lineare ma, non appena penetra la cellula batterica, si chiude circolarmente. La forma circolare del DNA del fago è utile al virus per massimizzare la resa della sua replicazione producendo centinaia di copie del suo genoma e portando così la cellula alla lisi. La replicazione del genoma fagico avviene attraverso uno specifico meccanismo detto rolling circle: in questo modo, il genoma nella sua forma circolare viene sfruttato per replicarsi in modo continuo producendo copie di genomi lineari. Questo meccanismo parte con la produzione di un taglio, presso l’origine di replicazione, in una sola delle due eliche del DNA. L’estremità 5’ dell’elica tagliata è così lasciata allontanarsi dalla molecola circolare mentre il DNA circolare intatto agisce come stampo per l’elica leading, quindi quella replicata in maniera continua. Con il procedere della replicazione l’estremità 5’ del filamento tagliato è srotolata fuori come un filamento libero di lunghezza crescente: per evitare aggrovigliamenti questo viene subito attaccato dalle proteine SSB, dall’inglese single strand binding proteins, che ne stabilizzano la struttura impedendo anche alle due eliche di riassociarsi. Mentre il cerchio ruota, il filamento lineare a singola elica viene utilizzato come stampo per un’elica lagging. L’elica che funge da stampo leading, intanto, non si linearizza, quindi alla fine della replicazione si può ottenere una molecola lineare di DNA a doppia elica ben più lunga rispetto circonferenza della singola elica circolare, perché su questo la DNA polimerasi può continuare a replicare senza interruzione. Il genoma duplicato conterà delle sequenze ripetute, ognuna caratterizzata da una sequenza palindromica specifica: il sito cos. Attraverso l’azione di una endonucleasi del fago, il sito cos verrà quindi riconosciuto dalla proteasi e presso la sua sequenza verrà prodotto un taglio asimmetrico. Il risultato della replicazione del filamento che rimane singolo e legato dalle proteine SSB è, infatti, un lungo concatenamero di genomi legati fra loro presso i siti cos. La sua genesi è spiegata dal fatto che la polimerasi che agisce in modo continuo sul filamento circolarmente chiuso, partendo dall’estremità 3’-OH, lega i nucleotidi che inserisce a questa estremità terminale del filamento singolo che si è aperto e disteso: quindi questo non potrà mai andare a staccarsi, finchè non sopraggiungeranno i sistemi regolatori specifici per la terminazione della replicazione, perché continuamente allungato e riprodotto dalla polimerasi. L’inserimento delle nuove copie genomiche nei rispettivi capsidi impiega proteine ATP-dipendenti che quindi consumano parecchia energia cellulare. Le copie genomiche sono inserite nei capsidi proteici ad alta pressione, così da semplificare i successivi processi di infezione. Il virione si completa quando le altre proteine strutturali che ne compongono la coda sono legate alla testa capsidica.