Aptameri: applicazioni in medicina

COSA SONO GLI APTAMERI?

Gli aptameri sono brevi catene oligonucleotidiche (20-100 basi) a singolo filamento, di DNA o di RNA o ancora peptidi artificiali che consentono l’interazione specifica con le proteine. Quando si viene a generare una struttura a singolo filamento, come può essere il doppio filamento di DNA denaturato o l’RNA, esse generano strutture 3D ben organizzate in modo da poter entrare in contatto con il target, ma soprattutto in grado di esplicare la propria attività. La metodica di generazione degli aptameri è stata messa a punto negli anni ’90, ma di fatto si sta rivalutando oggi il loro utilizzo, studio e isolamento. Essi vengono utilizzati principalmente nella prevenzione, terapia e diagnosi; infatti, grazie ad una serie di proprietà di queste molecole come la facilità di sintesi, alta stabilità, piccole dimensioni, bassa tossicità e immunogenicità, negli ultimi anni hanno riscontrato una rilevanza in ambito medico. La loro applicazione più importante è l’impiego come agenti antitumorali. Nello specifico un aptamero va a generare interazioni di tipo non covalente con la molecola bersaglio.

CARATTERISTICHE DEGLI APTAMERI

Gli aptameri vengono sintetizzati attraverso un processo chiamato SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), che rappresenta la colonna portante per l’ottenimento e il successivo uso degli aptameri. Si tratta di una metodica in vitro che permette di isolare fra un pool molto ampio di molecole di DNA o di RNA a singolo filamento in modo da ottenere il successivo riconoscimento con il target. Gli aptameri hanno molte delle caratteristiche in comune con gli anticorpi, anche se essi hanno alcune caratteristiche differenti aggiuntive:

• Produzione in vitro (elevata producibilità);
• Presentano elevata stabilità in presenza di solventi, o a ph differenti;
• Denaturazione reversibile senza perdita di specificità;
• Costi contenuti;
• Facilmente modificabili con traccianti o fluorofori senza perdita di selettività e specificità anche se questo pare non sia sempre vero, ma in linea di massima è così.

Ci possono essere problemi di suscettibilità dato che parliamo di molecole di acido nucleico a singolo filamento da parte di nucleasi e quindi anche in questo caso, per questa ragione il gruppo 2’-OH è spesso sostituito da altri gruppi, come per esempio con 2’- fluoro (2’-F), 2’-amino (2’-NH2), 2’-O-methyl oppure da quelli che vengono denominati LNA o Locked Nucleic Acid. Tutte queste modificazioni del 2’-OH ci permettono di aumentare la specificità e diminuire la suscettibilità degli apatmeri da parte delle nucleasi.

LA SELEX: METODICA DI SINTESI

La SELEX è una metodologia che nasce dalla evoluzione delle tecniche di sintesi in vitro di acidi nucleici e dalla disponibilità della PCR che permette di amplificare all’infinito sequenze di DNA e che permette di ottenere molte sequenze “degenerate” di acidi nucleici specifici per un legame con una proteina target. Il processo di selex lo si può compiere sia su DNA che su RNA. Questo grazie ad un processo preliminare ed aggiuntivo rispetto la PCR classica: la retro-trascrizione in vitro dell’acido ribonucleico. Un ciclo di selex consiste in:

1. selezione
2. separazione
3. amplificazione

Durante i cicli di PCR che costituiscono la SELEX possono insorgere mutazioni e queste possono far in modo che si vengano a creare aptameri con maggiore affinità con il target oggetto di studio. La metodica SELEX (systematic evolution of ligands by esponent enrichment) consiste nei seguenti passaggi:

1. Sintesi chimica di 10^13 -10^16 di RNA o DNA e successiva costruzione di una libreria
2. Incubazione con la proteina target: attarverso un passaggio di cromatografia per affinità
3. Rimozione degli oligonucleonucleoti non legati mediante lavaggio
4. Rimozione delle sequenze oligonucleotidiche legate alla proteina target (con una soluzione contenente per es. la proteina target)
5. Retro-trascrizione e PCR (nel caso il nostro campione contenga RNA) o solo PCR (nel caso il nostro campione contenga DNA) degli oligo che si sono legati
6. Trascrizione in vitro (RNA) o solo denaturazione (DNA) per separare i filamenti
7. Inizio di un nuovo ciclo fino a 5-10 cicli.

APPLICAZIONI DEGLI APTAMERI

I principali ambiti di applicazione di questa tecnologia sono: Bio-imaging, diagnosi, drug delivery e terapia, food inspection. Dal 1990 ad oggi sono state sviluppate una serie di metodologie SELEX per identificare aptameri contro biomarcatori di superficie e usando strategie diverse. SELEX può essere utile per selezionare biomarcatori noti per patologie, in quel caso si può purificare la proteina o fare la SELEX direttamente su un estratto di membrana, ma il target è noto.

Questa metodica può essere utilizzata per isolare biomarker nuovi, non noti, che identificano tutta una serie di patalogie. In questo caso non si è a conoscenza del target oppure può essere impiegata per la diagnosi di tumori. In questo contesto si ha un campione di cellule tumorali che presenteranno marcatori, alcuni noti, mentre altre cellule non avranno quel determinato marker. Andando a generare una libreria di acido desossiribonucleico di cellule tumorali e non solo, ecco che si può isolare un aptamero specifico per la linea cellulare tumorale in esame. L’aptamero andrà a legare in modo specifico con un marcatore e non a tutte le proteine della cellula. Questa metodologia consente non solo di differenziare le cellule tumorali da quelle che non rientrano nel nostro oggetto di studio, ma anche di identificare i ligandi per biomarcatori noti. Qualche anno fa è stato approvato un aptamero di RNA utilizzato come farmaco per la AMD, patologia associata alla maculopatia(malattia che porta in età avanzata a problemi di vista). Il target di questo aptamero è VEGF; ce ne sono molti altri in fase di sperimentazione, come quelli generati da APTACELLSENS. APTACELLSENS si è occupata di identificare aptameri in grado di realizzare quanto più precocemente diagnosi per diversi tipi di tumori.

Bioimaging e diagnostica

Quando parliamo di bio-imaging o molecular-imaging ci si riferisce a una serie di tecniche che vanno dalla PET, alla risonanza magnetica nucleare, Raggi X. Spesso durante queste procedure occorre iniettare al paziente un agente di contrasto che si espande in tutto l’organismo; la maggior parte di esso viene eliminato dall’organismo stesso e quello che rimane si concentra a livello delle regioni di target su cui si vuole eseguire la procedura di bio-imaging. Queste tecniche sono molto importanti per la diagnosi e il monitoraggio di varie patologie. In questo caso gli aptameri possono essere utilizzati (in corso di studio) per la diagnosi attraverso la produzione di probe basati su aptameri: si prende un aptamero specifico verso un certo target molecolare per una specifica patologia ed esso si trova legato attraverso una molecola che funge da linker oppure è possibile utilizzare un radio isotopo o ancora una molecola fluorescente ed ecco che è possibile iniettare l’aptamero. Ciò è la base dei numerosi studi in corso su animali al fine di poter utilizzare gli aptameri per effettuare una diagnosi o un monitoraggio di una determinata patologia. Molti sforzi sono orientati, in modo similare come per il bio-imaging, nella messa a punto di aptameri utilizzabili in teranostica, e più nello specifico di provare che sia in grado sia di diagnosticare e monitorare lo stato di avanzamento di una patologia, sia di curarla. In questo caso invece di legare all’aptamero un radio isotopo, come nel caso precedente, si può legare l’aptamero che determina la specificità per una proteina con una nanoparticella drug carrier contenente l’agente terapeutico (es. chemioterapico), sonda radioattiva o agente fluoroforo. Validi esempi di applicazione degli aptameri su topo ci dimostrano come MUC-1, una particolare proteina, se over-espressa è coinvolta in una serie di tumori (pancreas, ovaie, seno, colon): questo è molto utile nello sviluppo mirato di tecniche diagnostiche atte ad identificare più precocemente patologie, come in questo caso gli stadi di formazione di cellule tumorali e verificarne la loro presenza.

Terapia

In terapia gli aptameri vengono impiegati sia come mezzo per il drug delivery di farmaci, sia come vere e proprie molecole terapeutiche. Uno degli aptameri attualmente in commercio ed approvato dalla FDA è Pegaptanib, conosciuto anche come Macugen, ovvero un farmaco anti angiogenico usato per curare la degenerazione maculare dell’età (AMD), fungendo come antagonista VEGF impendendo la crescita di vasi sanguigni dell’occhio che provocano la patologia. Inoltre gli aptameri sono spesso impiegati contro batteri e virus; recentemente sono stati studiati e usati per agire nella generazione di una terapie innovative contro Sars-CoV, virus dell’influenza di tipo A e B, il virus dell’HIV (sui quale va inibire la proteina che ne è la causa) e numerosi altri agenti patogeni e virali. Un’altro studio interessante a fini terapeutici è quello che vede coinvolti gli aptameri come target contro la TBA (Trombotic Binding Protein) in grado di esplicare l’attività antitrombotica all’interno dell’organismo.

Biosensori e food inspection

Gli aptameri sono impiegati nel settore agroalimentare, detto anche food inspection. Con l’impiega degli aptameri sono stati generati dei biosensori in grado di identificare la presenza negli alimenti delle Aflotossine, in particolare la Aflotossina B1. Questo è di fondamentale importanza in quanto negli alimenti le Aflotossine possono generare delle micotossine in grado di generare la cosiddetta muffa e di provocare gravi tossicità sistemiche dell’organismo umano, nonchè vengono reputate un agente cancerogeno. In questo contesto gli aptameri sono stati immobilizzati a cristalli di quarzo, i quali a loro volta sono legati ad un elettrodo d’oro. L’aptamero lega in modo più efficiente rispetto ad una comune proteina la tossina in esame.

Gli aptameri sicuramente si stanno rivelando essere strumenti molto utili; ci sono una serie di questioni non risolte ovviamente. Una di queste è la facilità di degradazione, anche se come già trattato prima possono essere aggiunte modifiche per rendere l’aptamero meno suscettibile alla degradazione, ma all’atto pratico si è visto che non sempre si ottengono i risultati sperati. Altro fattore da considerare è la potenziale tossicità e la facile escrezione mediante i reni. Ciò può essere sia uno svantaggio sia un vantaggio che dipende dai punti di vista e i limiti dei modelli utilizzati. Se si considerano le tabelle che mostrano lo stato dell’arte, si vede che i modelli sono per lo più topi e questi quasi certamente non riproducono la situazione reale negli esseri umani.