Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, le due ricercatrici che hanno rivoluzionato il mondo dell’editing genomico grazie alla tecnologia CRISPR, si sono aggiudicate il Premio Nobel per la chimica 2020. CRISPR ha rivoluzionato letteralmente questo campo già da qualche anno e in questo articolo vi spieghiamo di cosa si sta parlando esattamente.
IN BREVE
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IL NOBEL A CRISPR E L’EDITING GENOMICO
Emmanuelle Charpentier, biochimica, genetista e microbiologa francese, e Jennifer A. Doudna, biologa strutturale dell’Università di Berkley, hanno letteralmente stravolto il mondo della ricerca scientifica e in particolare quello dell’editing genomico. Nel 2012, infatti, le due ricercatrici, insieme ai loro due gruppi di ricerca, pubblicarono un importante studio su Science nel quale veniva illustrata la tecnologia CRISPR. Data la grande importanza scientifica di questa scoperta, proprio qualche settimana fa, è stato assegnato alle due ricercatrici il Premio Nobel per la chimica. L’Accademia reale svedese delle scienze ha valutato come grande, e importantissimo, il contributo apportato da questa tecnologia, definito come il metodo più efficace e diffuso utilizzato nell’editing genomico. Il presidente del comitato dei Nobel per la chimica, Claes Gustafsson, infatti, ha affermato che «In questo strumento genetico c’è un enorme potere, che riguarda tutti noi. Non solo ha rivoluzionato la scienza di base, ma ha anche portato a coltivazioni innovative e porterà a nuovi trattamenti medici all’avanguardia». La scoperta avvenne in maniera casuale: Emmanuelle Charpentier stava conducendo degli studi sullo Streptococcus pyogenes, quando ebbe a che fare con una molecola mai osservata in precedenza. Charpentier scoprì la TracrRNA (crRNA trans-attivatore, ovvero un piccolo RNA che svolge un importante ruolo all’interno del sistema difensivo CRISPR/Cas), riuscendo a dimostrare l’appartenenza di quest’ultimo all’antico sistema immunitario dei batteri, il CRISPR/Cas, in grado di contrastare ed eliminare i virus degradandone il DNA. La scoperta fu pubblicata nel 2012, anno in cui Charpentier iniziò una serie di esperimenti con la collega Jennifer Doudna. Insieme, sono state in grado di ricreare in laboratorio questa forbice genetica dei batteri, riprogrammandola e manovrandola. Così facendo, l’hanno utilizzata per tagliare qualsiasi molecola di DNA in qualunque sito, dimostrando la concreta possibilità di riscrivere il codice della vita. Prima di affrontare il vero e proprio nocciolo della questione, è doveroso cercare di capire in che campo scientifico ci stiamo muovendo. Dobbiamo, quindi, comprendere cos’è l’editing genomico. Quando parliamo di editing genomico, stiamo parlando di un certo tipo di ingegneria genetica che si occupa di manipolare il DNA, cancellando dei “pezzi”, modificandoli e sostituendoli. L’editing genomico è stato introdotto per la prima volta negli anni ’90 e per ovvi motivi non era efficiente come lo è oggi.

Prima di CRISPR, sono state utilizzate tre famiglie di nucleasi ingegnerizzate:
- le meganucleasi;
- le nucleasi a dito di zinco (ZFN);
- le nucleasi a base di effettore simile ad attivatore di trascrizione (TALEN).
Nel 2018, sono state utilizzate delle vere e proprie “forbici molecolari” per la modifica del DNA. Queste nucleasi attuano delle rotture a doppio filamento, sito-specifiche, chiamate DSB (Double-Strand-Break) all’interno del genoma. Queste rotture del doppio filamento, successivamente, vengono riparate attraverso il Non-Homologous End-Joining (NHEJ) o la ricombinazione omologa (HR), determinando mutazioni mirate, ovvero le modifiche stabilite in precedenza. Da questa piccola premessa, possiamo finalmente addentrarci nel cuore dell’articolo.
COS’È E COME FUNZIONA CRISPR?
Prima di tutto, partiamo con le presentazioni: la sigla CRISPR, che si legge “crisper”, è l’acronimo di Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente interspaziate) ed è una delle tecnologie più innovative che sta offrendo un nuovo modo di approcciarsi alla modificazione genetica. L’origine di questa rivoluzione parte da delle particolari sequenze batteriche che servono a organizzare quello che è un vero e proprio archivio genomico in cui il batterio tiene traccia dei virus che ha incontrato e sconfitto. Ma qual è la vera rivoluzione di CRISPR e perché viene chiamata CRISPR/Cas9? CRISPR anziché prendere e spostare segmenti di DNA, è in grado di correggere il DNA direttamente nella sua collocazione originaria.
CRISPR/Cas9 può essere definita come una piccola macchina molecolare costituita da due componenti fondamentali:
- una nucleasi, chiamata Cas9, il cui ruolo è quello di idrolizzare i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi, effettuando così un vero e proprio taglio del DNA;
- un RNA guida, chiamato gRNA, in grado di guidare la proteina Cas9 verso il sito da recidere. Questo gRNA è il prodotto di due RNA che lavorano in sequenza, di cui uno si occupa a legare il DNA da tagliare, mentre l’altro serve ad attaccarsi all’enzima.
CRISPR, quindi, scandaglia il genoma andando alla ricerca del gene di interesse della sequenza che le è stato indicato ed effettua la modificazione desiderata. Questa macchina molecolare si basa su un sistema che si è evoluto nel mondo microbico, dove i batteri ed archeobatteri che lo utilizzano per difendersi dai virus come se fosse un vero e proprio sistema immunitario. I ricercatori capirono che, riadattandolo, sarebbe potuta diventare una macchina molecolare utilizzabile nell’ingegneria genetica di precisione. Quando il virus inietta il suo DNA nel batterio per infettarlo, per riprodursi, quest’ultimo produce delle piccole molecole di RNA che formano una sorta di identikit del virus che lo sta infettando, fondendolo insieme a una proteina sentinella: la famigerata proteina Cas9. Questa proteina, un’endonucleasi, passa in rassegna l’ambiente cellulare per cercare corrispondenze. Se trova un DNA che corrisponde all’identikit virale, inizia la degradazione di quel DNA, bloccandone, quindi, l’infezione. Cas9 è la proteina più utilizzata con questa tecnologia poiché la sua famiglia genica è molto numerosa e permette, quindi, numerose possibilità di azione. All’interno, troviamo l’RNA guida che si lega al DNA in corrispondenza di sequenze chiamate PAM (Protospacer Adjacent Motif) dove si àncora e inizia lo srotolamento della doppia elica al fine di trovare la corrispondenza con la sua molecola guida di RNA. Una volta trovata, si attivano i domini enzimatici, le forbici molecolari, che effettuano un taglio in entrambi i filamenti sul quale è possibile intervenire.
CHI HA CONTRIBUITO ALLA SCOPERTA DI CRISPR?
La prima traccia di una sequenza di DNA “atipica” fu rilevata all’interno di Escherichia Coli nel 1987 dal biologo molecolare Yoshizumi Ishino, dell’Università di Osaka. La particolarità di tale porzione di DNA risiede nel fatto che tra una sequenza e l’altra di DNA vi sia il cosiddetto DNA spaziatore. Nel 1989, all’Università di Alicante, Francisco Mojica, che stava lavorando con il suo team su Haloferax Mediterranei (batterio delle saline spagnole, tollerante al sale), scoprì che l’alta salinità influenzava le modalità con cui gli enzimi di restrizione tagliano il genoma del batterio. Dall’analisi dei frammenti di DNA emerse una struttura particolare, mai osservata fino a quel momento: una sequenza palindromica, ripetuta, di trenta basi separate da trentasei basi di spaziatori. Nel corso degli anni, Mojica trovò svariate e analoghe sequenze in diversi microbi, tra cui quelli responsabili della tubercolosi e della peste. Nel 2001, Mojica e Ruud Jansen proposero l’acronimo CRISPR per individuare queste sequenze. Francisco Mojica è l’esempio per eccellenza di quanto la scienza debba essere libera di indagare ed esplorare, guidata dalla pura curiosità poiché i fenomeni riguardanti il batterio delle saline spagnole, furono considerati poco interessanti dalla Comunità Scientifica e, ad oggi, invece, possiamo sostenere che quella ricerca abbia aperto nuove porte alla rivoluzione biotecnologica.
Dopo Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, di cui vi abbiamo parlato ampiamente poco più sopra, ci sono stati anche altri scienziati che hanno contribuito notevolmente a questa straordinaria tecnologia. La scienza, d’altronde, è un’impresa collettiva e proprio per questo sono molti i ricercatori che hanno contribuito alla storia di CRISPR. Il biochimico Feng Zhang e il genetista, e ingegnere molecolare, George Church, ad esempio, hanno riadattato l’idea delle due ricercatrici per farla funzionare nelle cellule degli organismi superiori. In pochi mesi, sono riusciti a capire che era effettivamente possibile applicare questa tecnologia anche nelle cellule di esseri umani. David Liu, invece, chimico e biologo americano del Broad Institute, è stato incluso da Nature tra le dieci personalità scientifiche più importanti del 2017 poiché colui che ha messo a punto il CRISPR 2.0 in grado di modificare l’identità delle singole lettere, senza eseguire alcun taglio al DNA. Molte tappe percorse da questa tecnologia sono sparse nel mondo e in molti hanno contribuito alla crescita come anche l’Università di Trento che ha messo a punto una nuova variante di CRISPR, chiamata EvoCas9, la quale presenta una maggiore precisione rispetto alle varianti wild-type. Questa tecnologia è estremamente versatile e sta funzionando in tutti gli organismi in cui viene usata come insetti, piante, mammiferi, nematodi.

QUALI SONO I VANTAGGI DI CRISPR?
La tecnologia CRISPR con il passare del tempo si è evoluta, e non poco, in quanto ha acquistato nuove capacità come, per esempio, effettuare delle correzioni al DNA senza tagliarlo ed evidenziare specifiche sequenze di interesse. Nelle applicazioni più semplici, CRISPR interviene per saldare la lesione, introducendo qualche lettera casuale e inattivando così il gene. Questa tecnica viene utilizzata dai ricercatori al fine di studiare un gene specifico d’interesse in modo da osservare gli effetti che ne derivano sull’organismo. Questo porta a una condizione detta di knockout.
CRISPR si può utilizzare anche in altri modi: è possibile spegnere le sue forbici molecolari e legare un altro enzima in grado di cancellare e riscrivere, cambiando chimicamente l‘identità delle basi e consentendo così di poter effettuare interventi di precisione, lettera per lettera. La versatilità di CRISPR consente di legare altri componenti come degli attivatori di trascrizione che di conseguenza sono in grado di legarsi alla proteina stessa, a una coda peptidica o all’RNA. Quando la proteina raggiunge il bersaglio, che le viene indicato fornendole la guida su misura, attira il macchinario di trascrizione. Il gene d’interesse, quindi, viene espresso permettendo di vedere gli effetti di una sua maggiore o minore espressione. È possibile anche legare degli inibitori di trascrizione per cui la proteina Cas9 va sul bersaglio e ostacola l’arrivo del macchinario di trascrizione. Oppure, è possibile legare un’etichetta fluorescente (CRISPR LiveFISH) per cui il sistema CRISPR diventa un sistema di imaging che ci consente di studiare la posizione di un gene all’interno del genoma e anche la struttura tridimensionale di quest’ultimo.
CRISPR ha diversi vantaggi che la rendono la tecnologia adatta per poter fare un passo in avanti nel mondo delle biotecnologie:
- Economica: il costo di un esperimento si aggira intorno a un centinaio d’euro;
- Riprogrammabile: mentre con le altre tecniche di editing genomico bisognerebbe produrre una nuova proteina per ogni esperimento, per CRISPR, invece, la situazione è molto più semplice in quanto basterebbe fornire un RNA guida, facilmente realizzabile in laboratorio;
- Innovativa: si rinnova continuamente ed è semplice perché, in poche settimane e con pochi ricercatori, è possibile condurre esperimenti che in precedenza prevedevano consorzi internazionali e mesi, se non anni, di lavoro;
- Affidabile: ovviamente nulla è infallibile ma è sicuramente una tecnologia molto precisa rispetto ad altre;
- Rivoluzionaria: sta cambiando il modo di lavorare nei laboratori, sta riaprendo filoni di ricerca che prima si erano chiusi a causa delle difficoltà tecniche e ne sta aprendo di nuovi.

Le applicazioni di CRISPR
Le applicazioni di CRISPR/Cas9, che in questo anno particolare hanno dato modo alle due scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna di vincere il Nobel per la Chimica, risiedono tra le tecniche ad oggi più utilizzate per il genome editing o, tradotto in italiano, modificazione del genoma. Inoltre, la metodologia di CRISPR/Cas9 viene messa in atto anche negli studi su colture cellulari, utili nelle fasi precliniche della sperimentazione farmaceutica e non solo. Per esempio, le cellule di topo possono essere ingegnerizzate così da essere rese fluorescenti ingegnerizzando un particolare vettore usato per l’inserimento del DNA esogeno con una particolare proteina: la GFP (Green Fluorescent Protein).
CRISPR viene utilizzata moltissimo in campo medico in quanto viene utilizzata negli studi su malattie tra cui la malattia di Huntington, l’emofilia, la fibrosi cistica, la talassemia, diversi tipi di leucemia e moltissime altre. L’applicazione, però, più dibattuta e conosciuta in ambito medico e scientifico è quello che ha visto al centro, tra il 2017 e il 2018, lo scienziato cinese He Jiankui della Southern University of Science and Technology di Shenzhen che ha operato la modificazione genetica di due embrioni da cui poi sono nate due gemelle, a cui è stata operata una immunogenizzazione contro il virus dell’HIV attraverso la modificazione del gene CCR5. Per questo, lo scienziato è stato licenziato dalla sua stessa università, condannato a tre anni di prigione con una multa di tre milioni di yuan, in quanto, oltre a falsificare diversi documenti e noncurante delle altre mutazioni presenti nei due embrioni, decise di impiantarli lo stesso in utero. Vi sono altre applicazioni, però, che hanno rivoluzionato il mondo scientifico attraverso il “taglia e incolla” del DNA: l’applicazione di questa metodica sulle piante ha portato non solo a piante geneticamente modificate, ma alla selezione dei vegetali che, a causa del cambiamento climatico, sarebbero destinati ad estinguersi a permanere nel nostro continente, andando a modificare, per esempio, i geni per la resistenza al freddo com’è avvenuto nel pomodoro. Anche facendo sviluppare del riso resistente all’attacco di determinati insetti, facendo sì che si usino sempre meno insetticidi e pesticidi portando ad un minor impatto ambientale e per l’uomo stesso, per esempio. Altro aspetto ambientale da non sottovalutare è la produzione di biodiesel: l’azienda Synthetic Genomics fondata nel 2017 dal biologo Craig Venter ha cercato di mutare, con la tecnologia di CRISPR/Cas9, il genoma dell’alga Nannochloropsis gaditana, facendo sì che essa producesse molti più lipidi da impiegare per ottenere del carburante a basso impatto non solo ambientale ma anche economico.
Tra le applicazioni più avveniristiche, invece, abbiamo:
- Editing linea germinale: quello che viene fatto riguarda solo l’individuo su cui si sta operando, mentre invece la modificazione genetica viene attuata a livello embrionale oppure di progenitori di cellule uovo o spermatozoi. A quel punto, però, non parliamo più solo dell’individuo a cui viene effettuato il trattamento ma anche di tutta la sua discendenza. Questo pone diversi problemi di sicurezza e numerose riflessioni bioetiche. Questo tipo di esperimenti sono già stati avviati in Cina, Gran Bretagna e Stati Uniti e quello che è stato fatto, sostanzialmente, è stato modificare, in embrioni ai primissimi stadi di sviluppo, dei geni interessanti dal punto di vista scientifico poiché coinvolti in gravi malattie genetiche oppure perché responsabili di problemi nello sviluppo embrionale. La cosa importante da sottolineare è che non sono mai stati trasferiti in utero, non è mai stata avviata una gravidanza e lo sviluppo è stato sempre interrotto al 14° giorno, per cui è una ricerca molto controllata. Procedura molto diversa da quella effettuata dal biofisico He Jiankui.
- Xenotrapianti: con CRISPR si stanno “producendo” maialini il cui DNA è stato ripulito dalla presenza di virus che potrebbero essere un rischio per l’uomo e si sta lavorando per modificare dei geni che potrebbero essere implicati nel rigetto, con l’obiettivo di produrre organi animali utilizzabili sull’uomo. Questo perché la richiesta degli organi è molto più elevata rispetto all’offerta e le liste d’attesa sono molto lunghe. Ovviamente, questo settore è molto in bilico a livello etico.
- Settore dei gene drive: con uno stratagemma basato su CRISPR, si può fare in modo che la variante genica d’interesse venga ereditata non al 50% dai discendenti ma, virtualmente, al 100%. Sostanzialmente, i gene drive sono degli acceleratori di diffusione dei geni che potrebbero essere molto utili su specie come zanzare che trasmettono malattie come la malaria. Non essendo ancora riusciti a bloccarla tramite un vaccino, i ricercatori stanno lavorando per rendere le zanzare resistenti al Plasmodium malariae, oppure far nascere solo maschi incapaci di pungere e, di conseguenza, incapaci di trasmettere la malattia, o altrimenti rendere le femmine sterili.
