Traduzione RNA: definizione e mantenimento dell’identità personale

LETTURA E ATTUAZIONE DEL CODICE GENETICO

Il processo di traduzione dell’RNA segue quello di trascrizione del DNA ed è il meccanismo attraverso cui il nostro organismo interpreta e attua le istruzioni descritte nel codice genetico dopo averle lette con cura. Ipotizziamo di aver acquistato un tavolo per il soggiorno. Una mattina ci viene portato a casa dal corriere insieme ad un bel blocchetto di istruzioni per il montaggio. Si veda la trascrizione del DNA come il processo di lettura delle istruzioni. Dopo averle lette con attenzione, appuntiamo i punti principali del montaggio e scriviamo una scaletta delle cose da fare. La traduzione dell’RNA è il processo di rilettura della scaletta e di montaggio attivo del tavolo, passo dopo passo, sulla base degli appunti che abbiamo preso in precedenza.

Traduzione e trascrizione RNA

Nel caso del nostro organismo, dalla lettura del DNA deriva appunto un RNA al cui interno sono scritte le informazioni necessarie per il montaggio e l’assembly delle proteine. La nostra è una macchina biologica composta in grandissima parte da proteine, esse sono indispensabili per il corretto funzionamento dell’intero organismo e sono alla base di tutti i nostri comportamenti, dal movimento concreto al pensiero astratto. Difficile da credere che alla base di un costrutto intangibile come il pensiero umano vi siano ioni e molecole, eppure senza le proteine e senza la traduzione dell’RNA probabilmente non saremmo in grado di pensare, né di vivere. Il trasporto attivo e passivo ha base proteica, se non ci fossero recettori, canali e pompe di membrana, i segnali chimici ed elettrici non potrebbero diffondersi all’interno del nostro corpo, di conseguenza non potremmo muoverci, non potremmo parlare, non potremmo mangiare, saremmo finiti ancor prima di nascere. La risposta immunitaria non si innescherebbe, ma se anche si innescasse non avremmo gli anticorpi necessari per combattere i patogeni, dal momento che anch’essi sono proteici, così come lo sono gli antigeni non-self presenti sulla membrana delle cellule estranee al nostro organismo. Senza traduzione dell’RNA non potremmo produrre enzimi come l’ATP sintasi, e senza di esso non sarebbe possibile completare la catena respiratoria, di conseguenza non saremmo in grado di produrre energia per noi stessi e per il nostro sostentamento.

Proteine alla base dell’identità

Gli esempi riportati nel paragrafo precedente sono solo alcuni tra i tanti possibili. Senza traduzione dall’RNA alle proteine, non solo non saremmo capaci di vivere, ma non saremmo neanche in grado di sviluppare un’identità personale, né di immagazzinare ricordi. Ovviamente l’impossibilità di muoversi e nutrirsi esclude a priori anche tutte le altre eventuali attività tipiche dell’essere umano, ma ipotizziamo di poter sopravvivere anche senza proteine, in ogni caso l’uomo senza di esse non potrebbe svilupparsi dal punto di vista sociale e relazionale e non potrebbe definire una propria personalità. L’essere umano è frutto di ricordi e apprendimenti che lo rendono cosciente. La rete di memorie altamente interconnesse che lo rende unico rispetto agli altri animali ha proprio un fondamento proteico. È stato visto che, arrestando la sintesi proteica durante il consolidamento di un ricordo, questo viene perso, proprio perché viene bloccata la formazione del link proteico che lo avrebbe dovuto collegare alla rete (Kida et al., 2002).

Traduzione RNA: dove avviene

La sintesi proteica, in seguito alla traduzione dell’RNA messaggero (mRNA), avviene nei ribosomi, organelli piuttosto grandi all’interno della cellula (20nm) che possono essere sia liberi nel citoplasma con il compito di sintetizzare le proteine solubili, sia posizionati sulla membrana del reticolo endoplasmatico rugoso (RER), al fine di sintetizzare le proteine da muovere e posizionare dentro lo spazio del reticolo stesso. Dopo la sintesi, le proteine vengono foldate (ripiegate) e distribuite alle unità cellulari che le richiedono, ma prima attraversano una lunga serie di controlli che verificano la correttezza dei ripiegamenti e valutano la qualità molecolare. Una proteina che per qualsiasi motivo non viene sintetizzata o foldata correttamente, viene corretta o eliminata, questo proprio per impedire che ci siano dei gravi errori all’interno del sistema biologico umano. Se per qualche ragione una proteina subisce una mutazione importante e non viene eliminata, può portare a gravi conseguenze. Si pensi ad esempio alle proteine che dovrebbero funzionare spontaneamente da oncosoppressori, se si inattivano per qualche mutazione inaspettata, facilitano notevolmente lo sviluppo di un tumore.

LA SINTESI PROTEICA IN BREVE

I ribosomi sono organelli ribonucleoproteici, ovvero costituiti da RNA per il 50% e da proteine per il restante 50%. Presentano due subunità distinte, una maggiore e una minore, che funzionano da scanner ed è tra le due che passa l’RNA da tradurre in proteina. Gli RNA ribosomiali (rRNA) possono essere di quattro tipi. L’rRNA 5S è il più piccolo di tutti. È costituito da soli 120 nucleotidi e viene trascritto da un gene specifico da parte dell’RNA polimerasi III. Gli altri RNA ribosomiali (58S, 28S, 18S) derivano tutti dal processing di un unico trascritto ad opera dell’RNA polimerasi I. Nel complesso ritroviamo numerose proteine che, associate agli RNA stessi vanno a costituire la subunità maggiore e la subunità minore del ribosoma. Gli rRNA non sono gli unici RNA esistenti all’interno della cellula. I tRNA (RNA di trasporto) ad esempio sono i trasportatori degli amminoacidi (raggruppati in anti-codoni) che andranno poi a costituire la proteina; sono relativamente piccoli e riescono ad entrare perfettamente all’interno dei ribosomi attraverso apposite cavità. L’mRNA è invece il foglietto illustrativo su cui sono scritte tutte le informazioni da seguire (codoni) per produrre la proteina di interesse per la cellula.

In brevissimo, codoni e anti-codoni altro non sono che sequenze nucleotidiche, come quelle del DNA, formate da tre basi azotate (adenina, guanina, citosina, uracile). La doppia elica del DNA è tenuta insieme dai legami che si formano tra la citosina e la guanina e tra l’adenina e la timina (uracile negli RNA). Allo stesso modo, gli anti-codoni dei tRNA vanno ad appaiarsi con i codoni corrispondenti sulla sezione di mRNA in scansione nel ribosoma. Da un lato il tRNA presenta l’anti-codone, dall’altro trasporta un amminoacido. Tanti tRNA si posizionano l’uno accanto all’altro lungo l’mRNA, di conseguenza tanti amminoacidi (AA) vengono trasportati e sistemati sequenzialmente al di sopra dell’RNA messaggero. Man mano tra di essi si formano dei legami peptidici e si va così a costituire la catena amminoacidica propria delle proteine.

Il ribosoma come scanner

Le due subunità, una volta accoppiate, vanno a formare 3 cavità pronte ad accogliere i tRNA: un sito accettore (A), un sito per il peptide (P), un sito per l’uscita dell’mRNA dal ribosoma (E).
Tutti i siti, in particolare A e P, sono collocati in parte nella subunità maggiore ed in parte nella subunità minore, dunque attraversano l’intero ribosoma. tRNA arriva nel sito A portando sulla coda un aminoacido attaccato. L’AA interagisce con la catena nascente, si stacca dal tRNA e quest’ultimo esce scarico dal ribosoma. Dopo questi passaggi il ribosoma si sposta di un codone e ricomincia il ciclo. Dunque ogni ciclo è caratterizzato dall’arrivo di un tRNA carico, dall’attacco del peptide trasportato alla catena nascente e dall’uscita del tRNA scarico; ad ogni ciclo si aggiunge un aminoacido.

Il ciclo di elongazione

Nel sito P troviamo il peptidil-tRNA che ha attaccato a sé la catena nascente della proteina; nel sito A entra invece l’aminoacil-tRNA, carico di un aminoacido. Abbiamo quindi a sinistra la catena nascente e a destra l’AA che deve essere attaccato. Si stacca il peptidil-tRNA dalla catena (si scarica), esce dalla parte opposta rispetto all’mRNA e si attacca alla catena polipeptidica l’aminoacil-tRNA che si sposta nel sito P diventando a sua volta peptidil-tRNA. Prima dell’inizio della traduzione ad ogni tRNA deve essere associato l’aminoacido corretto; questo meccanismo di
decodifica è fondamentale quanto la sintesi stessa. Dipende da una particolare categoria di enzimi chiamati
ammimoacil-tRNA-sintetasi, in grado di
catalizzare l’esterificazione di uno specifico amminoacido (o
di un suo precursore) ad uno dei possibili tRNA
corrispondenti, a formare un amminoacil-tRNA. Sono specifici sia per gli aminoacidi che per i tRNA. Una volta avvenuto il riconoscimento, legano l’AA con un legame estere tra il suo –COOH e l’–OH 3’ finale del tRNA.

Ad ogni codone corrisponde un amminoacido. La sequenza di inizio della sintesi è quella identificata dalla tripletta AUG (adenina-uracile-guanina) e indica l’inserimento dell’amminoacido metionina. Vi un unico codone che codifica per la metionina (AUG per l’appunto) ma vi sono 2 diversi tipi di tRNA in grado di riconoscere questa specifica tripletta. Il tRNAi serve esclusivamente per la prima metionina di ogni proteina, mentre tutte le altre metionine interne vengono portate dal tRNA normale. Il tRNAi negli eucarioti e negli archea svolge appunto la funzione di immettere il primo amminoacido (Met), mentre i batteri utilizzano come primo amminoacido l’N-formilmetionina (fMet), un derivato dell’amminoacido metionina, nel quale un gruppo aldeidico è stato aggiunto al residuo amminico.

Tre step della traduzione

Fino ad ora abbiamo parlato del ciclo di elongazione, ovvero la fase intermedia dell’intero processo, gli altri due step sono ovviamente quello di inizio e di fine. All’inizio, la prima metionina portata dal tRNAi, recluta solo la subunità minore del ribosoma. A questo punto si aggiunge la subunità maggiore, il tRNAi si sposta nel sito P ed inizia l’allungamento. Le subunità ribosomiali si assemblano se e solo se la traduzione inizia. La fase terminale del processo ha inizio quando il codone
letto nel sito A è un codone di stop (UAA, UAG o UGA). In questo caso quello che
entra dentro il sito A non è un tRNA (non esistono tRNA che riconoscono codoni di stop), bensì un fattore di termine. Quest’ultimo è una proteina con forma simile al tRNA che quindi si lega al ribosoma come fosse lui, ma che non ha nessun legame estere con alcun amminoacido, di conseguenza non si formerà alcun legame peptidico e la proteina si staccherà. Quando questa si stacca, si stacca anche l’mRNA e il ribosoma dissocia.

TRADUZIONE mRNA NELLO SPECIFICO

La prima base (guanina) a partire dall’estremità 5’ dell’mRNA è «rivestita» da un nucleotide alterato (5′ cap) e per questa ragione viene riconosciuta dalla subunità minore del ribosoma come punto di aggancio.  Dopo l’avvenuto riconoscimento, la subunità si sposta lungo l’mRNA senza tradurre nulla fino a raggiungere il primo AUG. Negli eucarioti la selezione del codone d’inizio da parte del complesso pre-inizio può essere facilitata dalla presenza di una specifica sequenza, la sequenza di Kozak (CACCAUGG) che comunque non sembra essere indispensabile dal momento che molti organismi non la possiedono. Dunque la subunità minore si lega al cappuccio metilato e scorre fino al codone della metionina dove è presente il tRNA d’inizio. In seguito viene reclutata la subunità maggiore che rende il ribosoma pienamente funzionale. L’intera sintesi proteica si basa sulla reazione della peptidil-trasferasi. Il gruppo amminico dell’AA legato all’amminoacil-tRNA, interagisce con il –COOH dell’AA legato al peptidil-tRNA; successivamente si ha una reazione di transaminazione che allunga la proteina lasciando libero l’OH del peptidil-tRNA.

Differenze con virus e procarioti

Solo nei batteri la sintesi proteica ha delle piccole differenze, ricordiamo infatti che la metionina iniziale è formilata.
L’ –NH iniziale è metilato con aggiunta di –COH (formile) con cui crea un legame ammidico. Il tRNAi dei batteri è specifico per la formil-metionina; questa tuttavia, in quasi tutti i batteri, viene staccata dopo la traduzione. La stessa cosa succede negli eucarioti: spesso la metionina iniziale viene rimossa da una peptidasi, ciò può succedere anche dopo l’aggiunta del secondo/terzo AA della neo-proteina. Nei batteri la sequenza di aiuto per il riconoscimento del codone iniziale è fondamentale perché non è presente alcun cap. La subunità minore riconosce una particolare sequenza (AGGAGG), chiamata Shine-Dalgarno (vicina ad AUG), affinché un RNA del ribosoma si appai con essa attraverso la formazione di legami a idrogeno. L’mRNA dei procarioti può contenere l’informazione per sintetizzare più di una proteina ed è chiamato policistronico; la stessa cosa è estremamente infrequente negli eucarioti dove ogni traduzione è indipendente. Nel procariote l’inizio della traduzione dell’RNA è definito dal riconoscimento della sequenza Shine-Dalgarno, successivamente la proteina viene regolarmente sintetizzata ed infine il ribosoma si stacca come di consueto. Indipendentemente, su un altro pezzo dello stesso mRNA, si assembla un altro ribosoma che sintetizza un’altra proteina. Ci sono delle situazioni, principalmente sfruttate dai virus, in cui il messaggero costruisce in alcuni punti di sé stesso, delle strutture che assomigliano a quella dei fattori d’inizio (5’ cap per intenderci). In questo modo, queste strutture che si formano intorno agli Internal Ribosomal Entry Sites (IRES), vengono scambiate per l’estremità del mRNA e consentono al virus di iniziare la traduzione non partendo da cap.

Cosa succede se l’mRNA presenta degli errori?

Supponiamo che il messaggero aberrante provenga dallo splicing di un trascritto primario in cui per errore sono stati
saltati degli esoni. La giunzione tra un esone giusto e uno sbagliato potrebbe portare ad un salto di frame che
automaticamente dopo pochi amminoacidi porterebbe alla formazione di un codone di stop. In questo caso la proteina
sintetizzata sarebbe più corta del previsto e il ribosoma si staccherebbe
prima del dovuto. Ogni volta che il ribosoma non giunge al termine della sintesi proteica, fino all’ultimo esone, l’mRNA viene considerato sbagliato e viene degradato. In che modo il ribosoma si accorge dell’errore? Il trascritto maturo è frutto della giunzione tra vari esoni; tutte queste giunzioni sono marcate da proteine specifiche le identificano. Man mano che il ribosoma traduce, le incontra e le asporta; se la traduzione va a buon fine raggiungendo l’ultimo esone, tutte le proteine marker vengono asportate. Al contrario, se si sta traducendo un messaggero aberrante, la sintesi finisce in anticipo a causa della formazione di un codone di stop, e parte delle proteine marker non viene eliminata. Queste, se rimangono attaccate al messaggero, attraggono delle esonucleasi che portano alla distruzione del messaggero stesso.

Silenziare la traduzione

Quello dell’RNA interference è un processo che ha come scopo il silenziamento della traduzione.
Venne stato osservato in seguito all’introduzione di più copie dello stesso gene, codificanti una stessa proteina, all’interno di un organismo: l’espressione della proteina diminuiva anziché aumentare. Alcune copie del gene venivano trascritte in anti-senso, questo faceva sì che si producesse un RNA complementare a quello messaggero che portava alla formazione di una doppia elica di RNA. Questa veniva rotta in tanti piccoli pezzettini, produttori di tanti piccoli RNA chiamati siRNA, che bloccavano la traduzione del messaggero.
Questi piccoli RNA-interferenti possono essere di varie forme:

• Small interfiring RNAs (siRNA): sono stati i primi scoperti, derivano dalla degradazione di una doppia elica di RNA (RNA senso ed anti-senso complementari), frammentata dalla proteina DICER. I piccoli siRNA si assemblano grazie ad un complesso detto RISC che elimina uno dei due strand della doppia elica. A questo punto vi si associano le proteine AGO (argonaute) e successivamente il piccolo RNA, insieme al complesso RISC-AGO, cerca la sua sequenza complementare sul messaggero. Di fatto una sequenza perfettamente complementare così piccola nel genoma umano non si può trovare, quindi questa viene riconosciuta come sequenza target indesiderata e viene distrutta;
• Micro RNAs (miRNA): sono dei meccanismi endogeni appositi codificati dalla cellula per regolare la traduzione dei messaggeri in una maniera post-trascrizionale (quando il messaggero è già stato prodotto). Sono prodotti di geni specifici. Il gene di un
miRNA tipicamente ha un suo promotore e una sua sequenza;
questa include una sequenza palindromica che va a formare una
doppia elica perfetta. Questa
sequenza ricorda molto una di quelle create dalla proteina DICER, quindi viene processata dalla proteina stessa e le viene tolto il loop, successivamente viene trattata da siRNA e viene associata al complesso RISC-AGO. Cerca di essere appaiata con l’RNA compatibile, ma i miRNA non sono mai complementari perché il loro scopo è quello di fermare la traduzione di un messaggero che non va tradotto;
• Piwi-interacting RNAs (piRNA): piccoli RNA (20-30 nucleotidi) a singola elica. La loro scoperta ha spiegato come mai l’introduzione di copie aggiuntive di un gene porta al decremento invece che all’incremento della sua espressione.

LA DINAMICA DELLE DIFFERENZE INDIVIDUALI

Le patologie, così come lo sviluppo sano, sono frutto di un lungo e continuo processo evolutivo, che si arresta solo con la fine della vita. L’identità stessa degli individui non può essere definita in termini univoci perché ciascuno si modifica continuamente in funzione delle transazioni che si creano tra il proprio modo di essere e l’ambiente nel quale vive. Anche al livello strettamente neurobiologico la dinamica è costante, non solo perché le continue influenze esterne vanno a modificare le connessioni cerebrali, ma anche perché il cervello è in continuo «rinnovamento». Difatti i circuiti non sono statici, continuano a cambiare nell’arco di vita di un neurone. Mentre i neuroni rimangono tali per anni, i recettori, importanti per la trasmissione sinaptica, e i canali ionici, fondamentali per il signaling, mutano e si rinnovano continuamente; i meccanismi di traduzione da RNA a proteine sono costanti ed in costante attività. Se le componenti cerebrali sono in continuo stato di flusso e sostituzione, com’è possibile che il senso di sé e la memoria rimangano costanti? È stato visto che i neuroni fanno un self-tuning della loro conduttanza, ovvero settano l’intensità elettrica target e la tengono in memoria, infine la ricreano allo stesso modo. In questo modo vengono rispettate e mantenute le differenze di ciascuno nonostante le continue ristrutturazioni proteiche (Marder & Prinz, 2002). Segue un esempio.

La concentrazione intracellulare del calcio nei neuroni biologici è una buona misura per l’attività elettrica della cellula. Se il livello di attività è troppo basso (a sinistra), la concentrazione di calcio scende al di sotto del valore target. In questo modo la sovraregolazione delle correnti di membrana depolarizzanti e la sottoregolazione delle correnti di membrana iperpolarizzanti in risposta alla ridotta concentrazione di calcio riportano l’attività del neurone al suo livello target. Allo stesso modo, l’aumento degli input sinaptici eccitatori e la diminuzione degli inibitori agiscono come feedback negativo per stabilizzare il livello di attività. Anche se la velocità di firing e quindi la concentrazione di calcio è troppo alta (destra), la regolazione delle correnti di membrana e sinaptiche nella direzione opposta ristabilisce il livello di attività target.

Ad ognuno i propri pattern sinaptici

Siamo tutti simili, ma nessuno di noi è esattamente uguale agli altri, si distingue non solo per le proprie esperienze di vita uniche, ma anche per come è fatto di base biologicamente. Nella figura sottostante vediamo la riproduzione di due network simili da cui dipende uno stesso outcome, nonostante alla base vi siano pattern sinaptici diversi. Da qui dipenderebbe la variabilità individuale: tutte le persone camminano, ma ognuno con un andamento differente. Tutte le persone risentono lo stress, ma alcune sono più suscettibili di altre. Ha senso infatti pensare che alcuni set di parametri siano associati ad una resilienza maggiore e potrebbero quindi spiegare come mai vi sono individui più predisposti allo sviluppo di un disturbo mentale rispetto ad altri. Un secondo modello ha supportato questa teoria. È stata indagata la risposta ad un particolare stress: il calore. I pattern risultanti erano simili, ma la frequenza cambiava. Diversi animali rispondevano allo stesso modo ad uno stesso stress, seppur con una modalità differente. A lungo andare lo stress rivelava gli effetti delle differenze criptiche tra i parametri, invisibili normalmente. Quando la temperatura saliva molto infatti, i diversi animali crashavano (non rispondevano più), ciascuno in un modo e in un tempo diverso, in funzione del loro pattern alla base. Tutti mostravano diversi tipi di crash rispetto a diverse perturbazioni (Tang et al., 2010).

Parametri di circuito differenti (ad esempio canali proteici di membrana e pompe ioniche) possono produrre un’attività di rete simile. Superiormente in figura osserviamo le tracce di due reti distinte con attività simile, sotto i valori di conduttanza sinaptica e di membrana per queste reti, evidentemente differenti tra una rete e l’altra. Nonostante i valori di base siano molto differenti, i pattern di attività si assomigliano. Da una base differente possono dipendere manifestazioni simili. Tutti siamo composti da cellule, tutti siamo in grado di rapportarci con gli altri, ma ognuno ha il proprio stile comunicativo. Che sia questo la manifestazione dell’assetto di base proprio di ciascuno?