Caspasi: molecole portatrici di morte

CASPASI: COSA SONO?

Come lascia intendere il titolo di questo elaborato, le caspasi sono molecole coinvolte nel processo di morte cellulare, indispensabili per il nostro organismo. Tendenzialmente quando si parla di «morte» il primo aggettivo che viene in mente per descriverla non è di certo «indispensabile», al contrario molti di noi la definirebbero «sgradita», «fastidiosa», «superflua»; grandi menti come quella di Ray Kurtzweil vorrebbero addirittura sconfiggerla. Tuttavia, la morte di cui parliamo oggi non va vista con lo stesso sguardo critico. Le cellule del nostro corpo periodicamente hanno bisogno di essere eliminate per poi essere rinnovate, o per altri motivi, dunque quello di morte cellulare è un processo che non può mancare nel nostro organismo (e non solo). Le caspasi sono le molecole grazie alle quali il messaggio di morte viene recapitato alla cellula per poi essere attuato, questa di conseguenza innesca una serie di processi che, in breve, la portano al suicidio.

Apoptosi e necrosi

Durante il ciclo cellulare, la cellula può decidere di morire per il bene dell’organismo. Parliamo di morte cellulare programmata, o apoptosi (apo = «da»; ptosi = «caduta»; caduta da), un termine greco che da l’idea di «sottrazione da qualcosa», nel nostro caso «sottrazione della cellula dall’intera comunità cellulare». Differisce dalla necrosi dal momento che la necrosi implica rottura della membrana e fuoriuscita del contenuto cellulare; è un segnale di danno e pericolo, può causare grande infiammazione ed insufficienza renale acuta per rilascio massivo di proteine dalle cellule rotte. L’apoptosi avviene invece per collasso controllato, senza rottura della membrana, dunque senza infiammazione. Di conseguenza la cellula si frammenta in modo tale che venga mangiata rapidamente dai fagociti presenti nei tessuti. La digestione è rapida, se non lo fosse, si arriverebbe allo stesso stato di infiammazione della necrosi perché prima o poi la cellula finirebbe per rilasciare il proprio contenuto anche in caso di apoptosi. DNA e organelli vengono fatti a pezzi, l’unica cosa che rimane intatta per poco tempo è la membrana. Trattasi di un meccanismo fisiologico, a differenza della necrosi.

Dal marmo grezzo alla statua

Prendiamo d’esempio l’evoluzione cerebrale dal bambino all’adulto. Durante lo sviluppo, nel sistema nervoso centrale, la maggior parte delle cellule viene digerita in seguito ad apoptosi. Si parla di pruning, ovvero quel processo che ci consente di «sfoltire» le nostre sinapsi per affinare sempre di più abilità e competenze. Tutti i tessuti vengono prima sovra-formati, poi «scolpiti». Un ulteriore esempio è quello delle mani: in stato embrionale produciamo tessuto interdigitale (le mani palmate per intenderci) che viene poi eliminato con il tempo. Questi processi di «scolpitura» sono resi possibili dal meccanismo apoptotico, quindi dalle caspasi senza le quali l’apoptosi non si innescherebbe. Seguono tre caratteristiche tipiche della morte cellulare programmata:

• I mitocondri sono il macchinario apoptotico per eccellenza. Dettano morte per rilascio di sostanze, soprattutto citocromo c (un classico esempio di ectopia, ovvero un elemento che quando si trova in un posto diverso, svolge una funzione diversa: il citocromo c nel citoplasma innesca l’apoptosi, nello spazio intermembrana assolve la funzione respiratoria). Tutto ciò avviene nell’apoptosi intrinseca (o da stress), vedremo più avanti che in quella estrinseca non sono coinvolti i mitocondri;
• La membrana plasmatica è asimmetrica (i due versanti non presentano la stessa composizione chimica), difatti la fosfatidil serina è mantenuta solo sul layer interno. Durante l’apoptosi avviene un «flip-flop» della fosfatidil serina: parte di essa slitta verso l’esterno e funge da segnalatore per i fagociti, come fosse un cartello giallo con scritto «mangiami!»;
• La membrana esterna non viene discontinuata come nella necrosi, ma vi è comunque una relativa permabilizzazione. Iniziano ad entrare sostanze che normalmente non entrerebbero. Questa fase del processo apoptotico è importante per i test di laboratorio perché può essere sfruttata per immettere coloranti all’interno della cellula senza che questa si rompa.

Caspasi, apoptosi e frammentazione

La prima osservazione dettagliata di morte cellulare programmata risale al 1965, ma il termine apoptosi nasce solo nel 1972. Le prime intuizioni relative al meccanismo cellulare risalgono al 1988 con la scoperta di Bcl-2, un oncogene (l sta per linfoma) che codifica per una proteina anti-apoptotica, mentre le caspasi, gli enzimi protagonisti della cascata apoptotica, vengono osservate per la prima volta poco tempo dopo, negli anni Novanta. Come dicevamo nei paragrafi precedenti, sono gli enzimi proteolitici responsabili della frammentazione interna della cellula; intervengono sui residui di acido aspartico delle molecole e frantumano tutto, il DNA (per attivazione a cascata delle endonucleasi), gli organelli, le altre proteine… Sono attivate per rimozione di una porzione inibitoria da parte di altre caspasi, e a loro volta possono andare ad attivare altre caspasi (o endonucleasi). Vengono ovviamente attivate solo quando è necessario, se fossero sempre attive collasseremmo su noi stessi. Vi sono caspasi iniziatrici che vengono innescate dalla cascata apoptotica (apicali, come le caspasi 9 e 8) e caspasi effettrici che agiscono per «uccidere» attivamente la cellula (come la caspasi 3). Per completezza si sottolinea che non tutti gli eventi apoptotici richiedono l’azione delle caspasi, vi è anche una forma di apoptosi caspasi indipendente che utilizza molecole alternative, ma questa è un’altra storia…

Nello specifico, l’apoptosi caspasi-dipendente estrinseca (o da ligando) è attivata dalla caspasi 8, quella intinseca dalla 9. L’ordine numerico di queste interessanti molecole lascia intendere che esse svolgono una funzione sequenziale, ad esempio viene spontaneo pensare che a valle del processo vi sia la caspasi 1, che a sua volta innesca la caspasi 2, e così via… In verità la caspasi 1 non c’entra nulla con l’apoptosi ma è una di quelle molecole grazie alle quali manifestiamo sintomi infiammatori come la febbre per attivazione del pirogeno endogeno interleuchina-1-β. Per completare il quadro generale, si fa presente che vi sono alcune molecole proteiche (dette IAP) in grado di inibire il processo apoptotico. Vanno ad agire proprio sulle caspasi già attivate, oppure prevengono la loro attivazione se ancora non è stata innescata. La loro funzione inibitoria rivolta direttamente alle caspasi, fa intuire la grande importanza di queste ultime. Sono proprio loro le chiavi di volta in grado di tenere attiva l’apoptosi, se vengono a mancare, la cellula non è in grado di morire, la qual cosa non sempre è positiva.

FUNZIONI E VIE DELL’APOPTOSI

L’apoptosi, oltre che per la morfogenesi (di cui abbiamo parlato prima) e per l’istogenesi (omeostasi tissutale e mantenimento della forma), è fondamentale per limitare la risposta immunitaria. Non possiamo tenere in circolo tutte le cellule immunitarie che vengono prodotte in seguito ad infezione. Il sistema immunitario e quello nervoso centrale sono gli unici due sistemi corporei in grado di avere memoria degli eventi. Per questo ci vacciniamo, per settare in memoria la presenza di un patogeno, in modo tale che vengano prodotte cellula anticorpali in prevenzione. Se per errore facciamo troppa apoptosi delle cellule immunitarie, non abbiamo più memoria di un antigene e perdiamo la protezione a lungo termine. Al contrario, se ne eliminiamo troppo poche, possiamo andare incontro ad insufficienza renale per accumulo di immunocomplessi.

Via estrinseca e via intrinseca

Ricapitolando, abbiamo due vie apoptotiche principali: la via estrinseca (o da ligando) e la via intinseca o (stress-induced) che può essere innescata sia da elementi esterni che interni alla cellula. Nella forma estrinseca vi è una molecola esterna (ligando) che innesca immediatamente la caspasi, il mitocondrio non viene coinvolto. La via intrinseca invece richiede il mitocondrio ed un sistema di proteine (Bcl-2) che trasduca il segnale.

• Il ligando-di-morte nella via estrinseca raggiunge il cosiddetto death receptor (presente su tutte le cellule) che «trimerizza» non appena riceve la molecola. A questo punto all’interno della cellula si associano le proteine Death Domain (DD) a formare un complesso detto DISC che va ad attivare la caspasi 8. A sua volta CASP8 va ad innescare le altre caspasi effettrici che portano a termine l’opera;
• Nell’apoptosi da stress, Bcl-2 trasduce il segnale apoptotico al mitocondrio che di conseguenza rilascia il citocromo c che a sua volta va ad attivare la caspasi 9. La famiglia molecolare di Bcl-2 include un gruppo di proteine anti-apoptotiche (pro survival) e due gruppi di proteine pro-apoptotiche. Bcl2 vero e proprio, il capostipite della famiglia, identifica le proteine pro survival. Altre come BH3-only (chiamate così perché presentano solo il dominio BH3) e Bax rientrano invece nel gruppo delle pro-apoptotiche. Sono molecole effettrici che vanno ad aprire pori nella membrana esterna mitocondriale per favorire la fuoriuscita del citocromo c (si parla di MOMP: Mitochondrial Outher Membrane Permeabilization). Il citocromo nel citoplasma va a legarsi con la caspasi 9 a formare l’apoptosoma che a sua volta va ad attivare altre caspasi e massimizza la risposta apoptotica. Tutto parte con la ricezione dello stimolo da parte di Bim o altre proteine della famiglia di BH3-only che di conseguenza vanno a stimolare Bcl-2 sulla membrana mitocondriale. Ad esso è collegato Bax che taglia la membrana e permette al citocromo c di fuoriuscire.

Cenni di patologia legati all’apoptosi

È bene sottolineare che i due pathways apoptotici non sono isolati, bensì in comunicazione. La caspasi 8 (estrinseca) può attivare la caspasi 9 (intrinseca) tramite la molecola Bid della famiglia BH3-only. In pratica, se la risposta estrinseca non è sufficiente, viene coinvolto anche il mitocondrio. Il processo apoptotico, una volta innescato, difficilmente può retrocedere, però può quantomeno arrestarsi. Come si anticipava precedentemente, la famiglia IAP (Inhibitors of APoptosis) include un gruppo di molecole in grado di arrestare il processo apoptotico. Normalmente ci difendiamo suicidandoci se un virus infetta la cellula, ma può capitare che i virus sovra-esprimano IAP per tenere la cellula in vita.

La stessa cosa viene spesso fatta dai tumori, che «soggiogano» più o meno direttamente le caspasi e prendono il controllo dei meccanismi apoptotici per rendere la cellula immortale. Nel contempo la mitosi prosegue, le altre cellule non muoiono, nel loro insieme si ammassano e il tumore cresce a dismisura. Spesso, in caso di tumori, è possibile osservare di frequente anche la mutazione di P53, il «guardiano del genoma». Questo normalmente comunicherebbe alla cellula un danno genico e la porterebbe ad apoptosi per evitare di replicare il difetto. Andrebbe ad innescare l’espressione di PUMA e NOXA, ovvero PH3-only particolarmente potenti che generalmente innalzano di molto la soglia apoptotica. Difatti ogni cellula cerca sempre di gestire i segnali apoptotici con riparazione di danni e correzioni, ma quando questi sono troppo gravi, l’apoptosi viene per forza innescata. Nelle cellule preziose come le staminali, il meccanismo apoptotico innescato da P53 viene bloccato, la stessa cosa accade, ahimè, in caso di tumore. In questo modo la cellula non è più in grado di suicidarsi per il bene delle altre e continua a replicarsi con tutte le sue mutazioni.

Caspasi nella piroptosi

La distinzione netta tra apoptosi e necrosi è stata recentemente rivisitata. Esistono forme di necrosi regolate, ad esempio la piroptosi. L’infiammazione è processo extracellulare, ma anche intracellulare. Se c’è un batterio nella cellula ad esempio, il segnale infiammatorio parte dalla cellula stessa. La caspasi 1 va ad attivare il cosiddetto l’inflammasoma che di conseguenza prende contatti con l’interleuchina-1-β (IL-1β). La membrana viene volutamente tagliata al fine di far uscire IL-1β per un tipo di secrezione non convenzionale. La risposta è infiammatoria, la morte è per necrosi perché la membrana si apre e il contenuto cellulare esce, ma è tutto programmato e finemente regolato come nel caso dell’apoptosi.

In pratica la segnalazione infiammatoria intracellulare porta all’assemblaggio dell’inflammasoma, un complesso che guida l’attivazione della caspasi-non-apoptotica (caspasi 1) per elaborare e rilasciare la citochina infiammatoria prototipica, IL-1β. Sotto stimoli infiammatori moderati, IL-1β viene rilasciata senza danni alla membrana, quindi senza necrosi. Alla sua massima attività (ad esempio, per rispondere ai patogeni intracellulari), l’inflammasoma attiva proteoliticamente GSDMD (gasdermin D), la proteina effettrice che va a formare grandi pori nella membrana plasmatica senza i quali non sarebbe possibile il rilascio massiccio di IL-1β. In questo modo, tuttavia, la cellula va incontro a necrosi.

Collaborazione tra molecole e organelli

Le caspasi non sono le uniche ad avere un ruolo centrale nell’apoptosi. Fino ad ora abbiamo visto il mitocondrio come un effettore passivo che riceve un ordine e lo attua, adesso lo vediamo in altri panni. Generalmente il mitocondrio alterna uno stato di fusione ad uno di fissione, e viceversa, non solo quando è danneggiato, ma anche in mitosi o per altri motivi, ad esempio a scopo energetico. Pare che in apoptosi prevalga uno stato di frammentazione, non solo perché durante la morte programmata è necessario smontare tutti gli elementi intracellulari. È stato visto che inibendo la frammentazione mitocondriale con DRP1, un RNAi (RNA interference) che silenzia i geni responsabili della frammentazione, il citocromo c non esce più dal mitocondrio.

Pur avendo indotto MOMP e la foratura della superficie di membrana da parte di Bax, il citocromo c non esce se il mitocondrio non frammenta. Da questi risultati sembra che il mitocondrio svolga una funzione attiva nell’apoptosi, non è solamente un effettore passivo. Dobbiamo vedere la cellula come un bellissimo orologio in cui ogni ingranaggio svolge la sua parte ed è centrale per il funzionamento degli altri. È sufficiente che una piccola rotella sia fuori posto per scombinare il funzionamento dell’intero sistema. È vero che vi sono meccanismi compensatori e risanatori in grado di gestire anche le situazioni difficili, ma come nella società, un solo ingranaggio alterato è potenzialmente in grado di condizionare tutti gli altri.