Colture cellulari: mega mini mondo

COLTURE CELLULARI: COSA SONO?

Le colture cellulari non sono altro che cellule in grado di moltiplicarsi “in vitro” (ovvero in laboratorio ed al di fuori dell’organismo vivente) in modo tale da essere utilizzate dai ricercatori come modello per l’esecuzione di innumerevoli esperimenti. Perché sono così importanti? Rappresentano il primo step nell’affascinante ed intricato percorso che porta allo studio degli effetti di un nuovo farmaco, nonché alla valutazione della potenziale tossicità (ma anche mutagenicità e cancerogenicità) provocata da quest’ultimo. Altra interessante applicazione delle colture cellulari riguarda lo studio a livello molecolare di tali modelli che consente di andare a fondo nei sub-meccanismi che consentono l’instaurarsi di una determinata patologia (grazie allo studio dell’espressione di alcuni geni).

Quali sono i vantaggi e gli svantaggi derivanti dall’utilizzo delle cellule in coltura?

Diverse sono le caratteristiche a vantaggio dell’utilizzo delle colture cellulari:

• Possibilità di tenere sotto controllo le condizioni ambientali (esse, infatti, necessitano del controllo di alcuni parametri per poter sopravvivere);
• Plasticità dei modelli;
• Caratterizzazione ed omogeneità (nella ricerca è di fondamentale importanza avere dei modelli ben standardizzati che permettano di riprodurre gli stessi esperimenti in tutto il mondo);
• Costi bassi e rapidità della risposta;
• Riduzione della sperimentazione “in vivo”, ovvero dell’utilizzo dei modelli animali con conseguente decremento dei problemi etici;

Tra gli svantaggi invece si annoverano:

• Sistema semplificato rispetto all’intero organismo e, di conseguenza, difficile correlazione tra le condizioni di coltura e le condizioni in vivo;
• Possibili interazioni tra la molecola di studio e le condizioni di coltura;
• Perdita di funzioni organospecifiche e di alcune attività enzimatiche;

Colture cellulari primare vs colture cellulari continue/immortalizzate

Le colture cellulari primarie derivano dall’isolamento di uno o più tipi cellulari da un campione di tessuto o organo, vengono anche definite “a termine” in quanto le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte. Quali sono le caratteristiche delle colture cellulari primarie?

• Limitato numero di cicli cellulari;
• Hanno maggiore probabilità di mantenere le caratteristiche delle cellule in vivo;
• Necessitano di continui prelievi da animali/pazienti;
• Condizioni di coltura più delicate;
• Maggiore variabilità (isolate da soggetti differenti);

Le colture cellulari continue sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza (per questo anche definite “immortalizzate”). Possono essere coltivate in vitro per un tempo indefinito. Riassumendo le loro caratteristiche:

• Proliferazione rapida e continua dipendente solo dalla presenza di metaboliti;
• Possono acquisire caratteristiche diverse dalle cellule in vivo (morfologia, fisiologia e corredo cromosomico);
• Disponibili commercialmente;
• Coltura più semplice (minori esigenze trofiche, ridotta inibizione da contatto);
• Variabilità ridotta;

Ma non finisce qui… In base alla tipologia possiamo ottenere un’ulteriore distinzione delle colture cellulari:

• Colture cellulari in adesione/aderenti: cellule che fanno parte di tessuti solidi (es. cellule nervose, epiteliali, fibroblasti). Crescono aderendo alla superficie di coltura Spesso richiedono l’interazione tra recettori di adesione di membrana e proteine adesive adsorbite sulla superficie di coltura (es. fibronectina, lamimina, poly-L-lisina, matrigel) L’adesione è necessaria per la proliferazione. Dove si allestisce una coltura cellulare aderente? Esse vengono fatte crescere in apposite piastre Petri oppure nelle fiasche fino ad occupare l’intera superficie disponibile (si dice che la coltura cellulare sia a “confluenza”). Le fiasche per colture cellulari generalmente utilizzate hanno dimensioni pari 12 o 75 cm². Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente. In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero (di cui parleremo più avanti) che permettono l’adesione di diversi tipi di cellule;
• Colture cellulari in sospensione: Cellule che crescono normalmente in mezzo fluido (es. cellule ematopoietiche). Crescono in sospensione, senza aderire alla superficie di coltura. Le piastre non richiedono, pertanto, gli accorgimenti appena elencati;

DI COSA HANNO BISOGNO LE CELLULE PER VIVERE?

Dopo aver allestito una coltura cellulare è di fondamentale importanza avere cura di rispettare tutti i parametri necessari per poter permettere loro di moltiplicarsi in maniera adeguata. Quali sono questi parametri? Beh, le colture cellulari altro non fanno che riprodurre un organismo “semplificato”. Vivreste mai senza cibo? Ecco, anche loro per poter crescere necessitano dell’apporto di sostanze nutritive quali zuccheri, amminoacidi, ormoni, vitamine, ioni ed appositi fattori di crescita. Oltre questi fattori “interni”, tuttavia, ci sono una serie di fattori “esterni” da dover controllare: sterilità, pH, concentrazione di anidride carbonica e ossigeno, temperatura, umidità e substrato. Vediamo nel dettaglio.

• Terreni di coltura (cibo per cellule): contengono i nutrienti essenziali al mantenimento ed alla crescita delle cellule in coltura. Essendo le tipologie cellulari differenti, con bisogni nutrizionali differenti, esistono diverse tipologie di terreni di coltura. Solitamente la differenza consiste nel contenuto di amminoacidi, sali e glucosio. Alcuni esempi di terreni “base” sono: Eagle’s Basal Medium (BME, EMEM), Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Nutrient Mixture F-10 (HAM’s F-10) e Nutrient Mixture F-12 (HAM’s F-12). Al momento dell’utilizzo il terreno deve essere completato con i restanti elementi quali gli amminoacidi (in primis la glutammina), vitamine (biotina, colina, folato ecc), sali e altri componenti vari come il glucosio, il rosso fenolo, la penicillina e la streptomicina, il sodio piruvato ecc. Fondamentale è l’aggiunta del siero al terreno di coltura. Si tratta di una formulazione aspecifica di fattori di crescita necessaria come sostegno alla crescita per molti tipi cellulari. Il siero riesce ad aumentare la capacità tampone, a proteggere dai danni meccanici ed a facilitare l’adesione. I principali sieri utilizzati sono quelli bovini e di cavallo. Prima del suo utilizzo, il siero viene disattivato in stufa a 56°C per 30’ allo scopo di eliminare il Sistema del Complemento, che potrebbe interferire con la crescita delle cellule;
• Sterilità: chi lavora a contatto con colture cellulari vive il costante incubo di ritrovarsi di fronte ad una contaminazione. Quest’ultima può essere di natura ambientale per cui è essenziale verificare che la stanza adibita per le colture cellulari sia a norma, le superfici sempre pulite. Inoltre l’operatore deve essere esperto in quanto anche lui è sottoposto a rischio di contaminazione (es. operando con i virus) per cui bisogna sempre lavorare in ambiente sterile e sotto cappa a flusso laminare. I tipi di contaminazione che possono “attaccare” le colture cellulari (e, di conseguenza provocarne la morte/inficiare la veridicità degli esperimenti) sono i batteri, lieviti, funghi e mycoplasma. Come è possibile evitare tutto ciò? Trattando i materiali da utilizzare con autoclavi e stufe/ acquistando materiali sterili e monouso, disinfettando tale materiale prima di introdurlo sotto cappa, irradiando le superfici con gli UV, manipolando tutto sotto cappa a flusso laminare;
• pH: il pH è quello fisiologico: 6.8 – 7.8 (a seconda dell’origine della coltura cellulare). Tale ph tende ad acidificare a causa dei prodotti del metabolismo cellulare. Per arginare questo fenomeno nei terreni di coltura si trovano: sistemi tampone (comunemente bicarbonato di sodio), rosso fenolo (indicatore di pH: giallo = pH acido, rosso-arancio = pH neutro, viola = ph basico). Se il terreno di coltura tende al viola, non deve essere usato!
• Concentrazione CO₂ e O₂: Gli incubatori, dove vengono poste le cellule, dispongono di particolari sistemi che permettono di controllare parametri quali CO2 ed O2. In particolare la pCO2 (pressione parziale CO2) è solitamente pari al 5% (pCO2 media nei tessuti) e serve a contrastare l’acidificazione del terreno dovuta al metabolismo cellulare. La percentuale di aria presente, invece, è pari al 95%;
• Temperatura e umidità: Il mantenimento della temperatura ottimale è garantito dagli incubatori termostatati. Essa dipende dal tipo di colture cellulari ma generalmente è pari a 37°C. Di solito le cellule possono sopravvivere a lievi ipotermie rispetto alla temperatura ottimale anche se quest’ultime possono recare danno/morte alle cellule. Il mantenimento di un corretto grado di umidità impedisce al terreno di coltura di evaporare. Pertanto, il fondo degli incubatori termostatati viene riempito di acqua (sterile) il cui livello deve essere costantemente monitorato;
• Substrato: Tipi diversi di cellule richiedono la presenza (o l’assenza) di un substrato proteico che favorisca l’adesione delle cellule stesse alla superficie. Esempi: cellule endoteliali e cellule neuronali richiedono un substrato più comuni: laminina, fibronectina, collagene, poli-L-lisina, gelatina, Matrigel (mix di proteine);

ALCUNE APPLICAZIONI DEI SISTEMI IN VITRO

Come già accennato, diverse sono le applicazioni delle colture cellulari, soprattutto quelle riguardanti il campo farmaceutico. Poniamo il caso di voler studiare una nuova molecola (farmaco) che sia in grado di combattere il cancro. Saremo, pertanto, interessati a conoscere il grado di citotossicità (proprietà di una sostanza di produrre a livello cellulare un qualche effetto tossico che si manifesta sotto forma di deviazioni dalla normale morfologia e funzionalità cellulare) nei confronti di un determinato tipo di cellule tumorali. Per fare ciò, ci avvarremo di appositi test di “vitalità” o “citotossicità” cellulare che vanno proprio a stimare l’entità del danno prodotto da una determinata sostanza nei confronti di una linea cellulare. I più famosi sono:

• Saggio con il trypan blue (colorante che permette di discriminare tra cellule vitali e cellule morte);
• Saggio dell’MTT (saggio colorimetrico che sfrutta l’abilità di questo reattivo, l’MTT, di ridursi a formazano, che darà una colorazione viola, grazie a degli enzimi presenti nei mitocondri delle cellule vive;
• Saggio di citotossicità (sfrutta una reazione che normalmente avviene nelle cellule ad opera della lattato deidrogenasi. Questo enzima, se è presente un danno a livello della membrana cellulare, tende a riversarsi nel terreno di coltura);

Altra interessante applicazione delle colture cellulari riguarda il campo dell’ingegneria tissutale dove vengono mixate le conoscenze della biologia cellulare a quelle della bioingegneria. Questa tecnica si propone di utilizzare le cellule per costruire, in laboratorio, tessuti biologici artificiali da sostituire a quelli danneggiati in seguito a malattia o trauma. La potenzialità di tutto questo? Aiuterebbe ad arginare le problematiche relative alla ridotta disponibilità di organi per trapianto ed il rischio di rigetto dell’organo trapiantato derivato da donatore. L’associazione di cellule con materiali biocompatibili e biodegradabili ha portato alla produzione di tessuti ingegnerizzati trapiantabili. Ma non finisce qui… Le colture cellulari trovano anche impiego nella produzione dei vaccini, sostituendosi ormai alle tecniche più “obsolete” che prevedevano l’utilizzo di cellule di mammifero (derivanti dalle uova) e che presentavano diversi svantaggi come la necessità di reperire la materia prima, la bassa flessibilità del modello, la frequente impossibilità di isolare il virus nelle uova embrionate ed il possibile verificarsi di mutazioni egg-adaptive (alterazione della struttura del ceppo vaccinale durante i passaggi seriali di crescita nelle uova). Le produzioni di vaccini basate su colture cellulari superano questi handicap, aggiungendo ai vantaggi una resa migliore, cicli produttivi più rapidi e tempi di consegna prevedibilmente più brevi.

Il futuro delle colture cellulari: transizione da 2D a 3D

Visti i molteplici utilizzi e proprietà viene da chiedersi… quale sarà il futuro delle colture cellulari? È previsto un ulteriore margine di miglioramento? Ebbene sì, la nuova frontiera della ricerca si basa sul passaggio dalle colture cellulari bidimensionali (2D) alle colture cellulari tridimensionali (3D). Perché farlo? Beh, diverse evidenze sperimentali hanno suggerito che questo tipo di tecnologia porterebbe all’ottenimento di esperimenti maggiormente performanti, con un consequenziale accrescimento delle rese. Quando vengono eseguiti esperimenti sulle colture cellulari in 3D, infatti, l’ambiente cellulare può essere manipolato in modo da imitare, a tutti gli effetti, le cellule in vivo e fornire dati molto più accurati sulle interazioni cellula-cellula, sulle caratteristiche tumorali, sui profili metabolici, sulla scoperta di nuovi farmaci, sulla ricerca sulle cellule staminali e su tanti altri tipi di patologie. Tecniche basate sui cosiddetti “scaffold” come il supporto basato su idrogel, materiali polimerici, fibre di vetro idrofile ed organoidi vengono impiegate, fornendo, ognuna a proprio modo, vantaggi ed applicazioni. Esistono anche tecniche prive di scaffold come le micropiastre a goccia pendente, la levitazione magnetica e micropiastre sferoidali con rivestimento a bassissimo attacco. Naturalmente, gli sforzi della ricerca sono mirati a continuare su questa scia per approfondire e migliorare il campo delle colture cellulari 3D. La sfida più grande? Eliminare il divario tra colture cellulari 2D e 3D in modo tale da approfondire gli studi su un illimitato numero di patologie talvolta quasi “inaccessibili” dal punto di vista della ricerca ed andare verso l’eliminazione dell’utilizzo dei modelli animali in modo da risolvere del tutto i problemi etici connessi alla sperimentazione.